新型固相時(shí)間分辨熒光免疫分析螯合劑合成
不詳 ?文長(zhǎng)春應(yīng)化所 潘利華 謝文兵 徐經(jīng)偉 ? 2008年11月01日 ? ?創(chuàng)新成果
日前，一種具有熒光性能、可用于稀土和蛋白質(zhì)連接的新型雙功能螯合劑（BTBCT）在中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所首次合成，并通過(guò)專家鑒定。
時(shí)間分辨熒光免疫分析（TRFIA）是一種新型的非放射免疫分析技術(shù)。它以稀土離子代替放射性同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)、多肽、激素、抗體、核酸探針，避免了放射性物質(zhì)半衰期長(zhǎng)、試劑盒使用壽命短、環(huán)境污染等弊端；通過(guò)對(duì)抗原抗體免疫反應(yīng)、核酸探針雜交反應(yīng)、靶細(xì)胞與效應(yīng)細(xì)胞的殺傷反應(yīng)等熒光強(qiáng)度的測(cè)定確定待分析物的濃度，達(dá)到定量分析的目的。它既有放射免疫分析（RIA）的高靈敏度，又有酶免疫分析（EIA）操作簡(jiǎn)便之優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)代生物分析技術(shù)中很有前途的免疫分析方法。
TRFIA最重要的特點(diǎn)是稀土離子作為熒光探針，量子產(chǎn)率高，Stokes位移大，發(fā)射峰窄，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)理想，熒光壽命長(zhǎng)。采用時(shí)間分辨技術(shù)，可消除激發(fā)光、電及樣品池等干擾，極大地提高了信噪比。
TRFIA的解離增強(qiáng)體系（液相TRFIA）以極高的檢測(cè)靈敏度實(shí)現(xiàn)了商品化，在科研和臨床中得到了廣泛應(yīng)用。但由于該體系需加入增強(qiáng)液將稀土離子解離下來(lái)后再進(jìn)行檢測(cè)，是一種間接檢測(cè)方法；還由于測(cè)量只能在液相中進(jìn)行，離子解離后不能產(chǎn)生特異的空間信號(hào)，不適于熒光成像、免疫組化、DNA芯片或在線檢測(cè)等，使應(yīng)用范圍受到限制。
為了擴(kuò)展TRFIA體系的應(yīng)用范圍，滿足不同領(lǐng)域的分析需求，建立一種能夠?qū)崿F(xiàn)直接檢測(cè)的固相TRFIA體系研究受到了國(guó)際生物醫(yī)學(xué)界的重視，而理想的雙功能螯合劑是實(shí)現(xiàn)固相TRFIA體系的關(guān)鍵。因此，研制一種適合所有需要特征的即熱穩(wěn)定性和動(dòng)力學(xué)螯合穩(wěn)定性，水溶性，有合適的激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)，具有能與稀土離子實(shí)行能量轉(zhuǎn)移的三重態(tài)和具有生物分子之間形成共價(jià)連接的功能基團(tuán)的螯合劑，已成為現(xiàn)代生物分析技術(shù)中最具有潛力、對(duì)研究者具有挑戰(zhàn)性的課題。
為了解決這些問(wèn)題，中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所開始著手固相TRFIA體系的關(guān)鍵技術(shù)——雙功能螯合劑研究。
項(xiàng)目組在國(guó)內(nèi)外研究基礎(chǔ)上，進(jìn)行了多種螯合劑核心配體、功能基團(tuán)等中間體的探討，通過(guò)有機(jī)-無(wú)機(jī)配位化合物合成與功能研究，選擇了以鄰-三聯(lián)苯為原料，經(jīng)傅氏?；磻?yīng)、酯酮縮合反應(yīng)和氯磺化反應(yīng)合成了BTBCT，經(jīng)熱差分析、紅外光譜、元素分析、核磁氫譜等表征，證明了BTBCT的結(jié)構(gòu)，建立了BTBCT的合成路線和方法。圖1為螯合劑BTBCT的結(jié)構(gòu)圖。
圖1 螯合劑BTBCT的結(jié)構(gòu)
將BTBCT與BSA溫育連接反應(yīng)，研究標(biāo)記條件和標(biāo)記比，利用紫外吸收分光光度法測(cè)定BTBCT-BSA標(biāo)記物溶液中BTBCT的濃度，將BTBCT-BSA與Eu3+螯合，形成BTBCT-BSA-Eu3+螯合物，用紫外光激發(fā)，得到了Eu3+螯合物的吸收光譜及特征發(fā)射光譜，如圖2、圖3所示。
圖2 BSA-BTBCT - Eu3+吸收光譜
圖3 BSA-BTBCT - Eu3+熒光發(fā)射譜
該螯合劑與稀土離子、蛋白質(zhì)形成的螯合物在紫外300～400nm有較強(qiáng)的吸收，在615nm附近有強(qiáng)的熒光發(fā)射光譜。相關(guān)參數(shù)及測(cè)試結(jié)果證明了BTBCT螯合劑具有雙向連接功能，表明該螯合劑具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
項(xiàng)目組還出于對(duì)新螯合劑結(jié)構(gòu)探索的需要，對(duì)有機(jī)-無(wú)機(jī)配位化合物的設(shè)計(jì)合成、構(gòu)效關(guān)系與性能進(jìn)行了研究，制備了多種尚未商品化的中間體。為進(jìn)一步開展新型固相TRFIA螯合劑的功能基團(tuán)研究進(jìn)行了有益的探索。
該研究成果不僅對(duì)基因、蛋白組學(xué)研究和腫瘤、遺傳基因變異以及重要病毒如艾滋病病毒等的原體診斷研究具有很高的實(shí)用價(jià)值，而且在消除放射性污染、保護(hù)環(huán)境方面具有重要意義。
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